TERAPIA EPIGENÓMICA EN LA DEPRESIÓN

Tema: Focalización epigenética de las histonas desacetilasas en el diagnóstico y tratamiento de la depresión

Mecanismo epigenómico tratado: Acetilación de histonas

¿Cómo se hizo?: Se usaron inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) en modelos murinos como efecto antidepresivo, ya que, se descubrió en este ensayo que pueden aumentar la acetilación de histonas (debido que en la depresión hay un desbalance de acetilación/desacetilación por el estrés crónico presentado previo a la depresión), lo que mejora la expresión de genes asociados con la plasticidad neuronal y la neurogénesis.

Resultados: Se demostró que el uso de inhibidores de HDAC regula positivamente la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), lo que resulta en una mayor plasticidad neuronal/sináptica y ejerce un efecto similar al antidepresivo sobre el comportamiento. Además del efecto antidepresivo, los inhibidores de HDAC promovieron el recableado neuronal y la recuperación de las funciones motoras después de una lesión cerebral traumática, sin embargo, aún no se han realizado algún ensayo clínico que demuestre su efecto en los humanos.

Referencias bibliográficas: 

1. Park H-S, Kim J, Ahn SH, Ryu H-Y. Epigenetic targeting of histone deacetylases in diagnostics and treatment of depression. Int J Mol Sci [Internet]. 2021;22(10):5398. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3390/ijms22105398

TÉCNICAS DE EDICIÓN EN ÁCIDOS NUCLEICOS PARA ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES

Tipo de edición: In vivo - somática.

Dirigido hacia: Genes PCSK9, ANGPTL3, APOC3, TTR, DMD.

Dirigido por: ZNF (nucleasa con dedos de zinc), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), CRISPR/Cas.

• Vectores usados: Vectores virales (Adenovirus, vectores de virus adenoasociados [AAV]), vectores no virales (nanopartículas lipídicas).

Órgano a tratar: Hígado (hepatocitos) y corazón (células musculares cardíacas).

Vía de administración: Parenteral.

Resultados

• Corto plazo (1 año): Mediante una sola administración, lograron modificar significativamente el gen TTR en el hígado del ratón, lo que resultó en una notable disminución de más del 97% en los niveles séricos de TTR durante un mínimo de 12 meses.
• Mediano plazo (3 años): Desde 2021, se centró en aplicar el sistema CRISPR/Cas9 al músculo mediante nanopartículas lipídicas. Su estudio preclínico involucró un modelo de ratón DMD con secuencias de exones humanizadas. Lograron la inducción de saltos de exones genómicos estables, restaurando efectivamente la expresión de distrofina muscular en voluntarios humanos hasta la actualidad.
• Largo plazo (5 años): Desde 2019, se utilizó la tecnología CRISPR/Cas9 administrada por nanoportadores para inducir mutaciones de pérdida de función en el gen Pcsk9. Este enfoque se dirigió eficazmente al hígado, que exhibió una alta expresión de Pcsk9, lo que resultó en una tasa de mutación exitosa de Pcsk9 del 60 % y una reducción significativa del 30 % en los niveles plasmáticos de LDL-C sin observar mutaciones no deseadas hasta la actualidad.

Figura 1. La aplicación del sistema CRISPR/Cas para la terapia de edición genética en ECV. Una variedad de sistemas de edición de genes centrados en el sistema CRISPR/Cas han demostrado resultados efectivos de edición de genes en varios modelos animales dirigidos a genes clave de enfermedades cardiovasculares con diferentes métodos de administración y, además, han logrado éxitos iniciales en terapias de edición de genes para enfermedades cardiovasculares en clínicas humanas. Abreviaturas: DMD, distrofina; LDL‐C, colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad; TG, triglicéridos; TTR, transtiretina. Obtenido de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC11224995/figure/mco2639-fig-0002/

Referencias bibliográficas:

1.- Wu X, Yang J, Zhang J, Song Y. Gene editing therapy for cardiovascular diseases. MedComm [Internet]. 2024;5(7). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1002/mco2.639

TERAPIA CON STEM CELLS EN EL ASMA EN MODELOS MURINOS

TEMA: Administración de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo atenúa la capacidad de respuesta de las vías respiratorias y la inflamación en un modelo de ratón con asma inducida por ovoalbúmina.

TIPO DE STEM CELL: Células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ADMSC).

MÉTODO DE OBTENCIÓN: Las ADMSC se recogieron de las almohadillas de grasa inguinal de ratones transgénicos con proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) y se analizaron con respecto a sus marcadores de superficie y potencial de diferenciación adipogénica y osteogénica.

VÍA DE ADMINISTRACIÓN: A cada ratón se le inyectó por vía intraperitoneal OVA al 0,1 %, mientras que en los animales de control, se administró un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por vía intraperitoneal en lugar de OVA. 

RESULTADOS:

• CORTO PLAZO (1 año): las ADMSC aisladas tienen capacidad de diferenciación multipotencial, disminuyó la capacidad de respuesta de las vías respiratorias y los recuentos de eosinófilos, redujo la infiltración de células inflamatorias, el número de células caliciformes que expresan moco en el pulmón en ratones expuestos a OVA, evitó significativamente la elevación de los niveles séricos de IgE, la alteración de la producción de citoquinas, además, atenua la hiperreactividad y la inflamación de las vías respiratorias inducidas por OVA. 
• MEDIANO PLAZO (3 años): Aunque el estudio no proporciona datos exactos sobre el tiempo, la inducción de una respuesta inmune más equilibrada sugiere que los efectos beneficiosos del tratamiento podrían mantenerse a mediano plazo, reduciendo la frecuencia y severidad de los síntomas asmáticos, ya que, afectó la regulación de la expresión de IL-10, Foxp3, IL-17 y RORγ en los pulmones y restauró el porcentaje de CD4+ CD25 + Foxp3 + Tregs.
• LARGO PLAZO (5 años): El artículo no habla sobre resultados a largo plazo, sin embargo, en un artículo más reciente (2), habla sobre nuevas técnicas que únicamente usa las vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales, un nuevo método prometedor en el cual inhibe la patología del asma como una reducción de la inflamación, la hiperplasia de células caliciformes y la hiperreactividad de las vías respiratorias.

Figura 1. La administración de ADMSC atenúa la inflamación de las vías respiratorias inducida por OVA. Obtenido de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446524/figure/fig03/

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Dai R, Liu J, Cai S, Zheng C, Zhou X. Delivery of adipose-derived mesenchymal stem cells attenuates airway responsiveness and inflammation in a mouse model of ovalbumin-induced asthma. Am J Transl Res. 2017 May 15;9(5):2421-2428. PMID: 28559992; PMCID: PMC5446524. Obtenido de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446524/#b12
2. Firouzabadi SR, Mohammadi I, Ghafourian K, Kiani A, Hashemi SM. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle therapy for asthma in Murine models: A systematic review and meta-analysis. Stem Cell Rev and Rep [Internet]. 2024 [citado el 19 de agosto de 2024];20(5):1162–83. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38492133/

ANIMALES TRANGÉNICOS - MODELO MURINO PARA EL ESTUDIO DEL ALZHEIMER

EJEMPLO DE ANIMAL TRANSGÉNICO

1. Tipo de animal transgénico: Ratón - Knock in Aβ humano no mutante (hAβ-KI). (1)
2. Método de obtención: Se empleó recombinación homóloga en las células madre embrionarias de ratón, modificando el gen App murino mediante la sustitución de tres aminoácidos en la secuencia del péptido Aβ. Este procedimiento permitió la humanización del gen, permitiendo así la expresión de Aβ humano tipo salvaje (hAβ) en el locus App. Resultando una línea de ratones con expresión de Aβ humano sin diferencias significativas en la localización ni en la cantidad de expresión de APP en contraste con el alelo murino original. (2)
3. Función: Replica características de la EA esporádica humana, como la producción de Aβ, sin la necesidad de sobreexpresión de APP, es útil para investigar la progresión de la enfermedad, identificar biomarcadores diagnósticos y evaluar la eficacia de potenciales terapias. (1)

Figura 1. Representación esquemática de las principales características del modelo murino human Aβ knock-in (hAβ-KI). Genéticamente, la secuencia del péptido Aβ de humano se encuentra insertada en el gen APP de ratón. Este modelo presenta síntomas de declive cognitivo y disfunción sináptica, neuroinflamación, alteración de la expresión génica y presencia de acúmulos de material de desecho positivos para la tinción PAS (ácido periódico-Schiff). Esquema realizado en la plataforma BioRender. Recuperado de: https://analesranm.es/wp-content/uploads/2023/numero_140_01/images/rev05_fig05.jpg

VENTAJAS DE ANIMALES TRANSGÉNICOS (3)

1. Al aumentar la producción de cultivos transgénicos, corresponden a una herramienta muy eficiente y poderosa para ayudar a combatir las insuficiencias alimentarias, alimentos más rentables, nutritivos y resistentes en base a la selección y cruzamiento genético.
2. Uso para la creación de proteínas farmacéuticas, sobre todo anticuerpos destinados al tratamiento de infecciones o proteínas para elaborar vacunas contra virus y bacterias patógenas
3. Pueden producir una gran cantidad del medicamento a bajo costo.
4. Resistencia a herbicidas, insectos, hongos
5. Elaboración/producción de nuevos fármacos.

DESVENTAJAS DE ANIMALES TRANSGÉNICOS (3)

1. Desequilibrios en los ecosistemas si poseen ciertas ventajas sobre especies silvestres, pérdida de la biodiversidad.
2. Riesgo de generar alergias, intolerancia y enfermedades autoinmunes.
3. Pérdida de función de un gen del huésped (debido a mutaciones, inserciones), expresión inapropiada del transgen, exposición a proteínas producidas por el transgen con efectos adversos.
4. Dependencia de monopolios biotecnologos.
5. Puede generar dependencia en el organismo del ser humano y llegar a una resistencia a determinados fármacos. 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Andreo-Lopez J, Bettinetti-Luque M, Campos-Moreno C, Gutierrez A, Baglietto-Vargas D. Aβ aggregation and propagation in transgenic models of Alzheimer’s disease. An R Acad Nac Med (Madr) [Internet]. 2023;140(140(01)):49–58. Disponible en: http://dx.doi.org/10.32440/ar.2023.140.01.rev05

2. Baglietto-Vargas D, Forner S, Cai L, Martini AC, Trujillo-Estrada L, Swarup V, et al. Generation of a humanized Aβ expressing mouse demonstrating aspects of Alzheimer’s disease-like pathology. Nat Commun [Internet]. 2021;12(1). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1038/s41467-021-22624-z 

3. O´Farril L, Caridad L. Transgénesis: una aproximación a sus riesgos y beneficios. Acta méd centro [Internet]. 2021 [citado el 28 de julio de 2024];15(1):141–55. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2709-79272021000100141

ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

Las bacterias sufren recombinaciones genéticas naturales que permiten la transferencia de genes entre especies no análogas, por medio del proceso de TRANSFORMACIÓN, permitiendo así que las bacterias capturen el DNA desnudo que se encuentra en el ambiente y lo incorporan en sus genomas penetrando por su pared desde el medio externo. La recombinación genética tiene lugar entre el ADN transformante y el ADN de la bacteria receptora, de esta manera las bacterias pueden capturar plásmidos (molécula pequeña de ADN circular), y cuando la misma muere el DNA liberado al ambiente puede ser capturado por otras bacterias (1).

ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

• Tema: Clonación y expresión de la conotoxina recombinante cal26a de Conus californicus en Escherichia coli. 
• Objetivo: Obtener la conotoxina cal26a de manera recombinante en E. coli para su análisis de actividad, así como para su posterior empleo en estudios de estructura y caracterización de blancos moleculares, entre otros. 
• Gen o secuencia a clonar: Gen que codifica para la conotoxina cal26a. Enzimas de restricción:  Nco I y Xho I (Promega). 
• Enzima ligasa: T4 DNA ligasa (Promega) la cual une las regiones complementarias de los sitios de corte de las enzimas de restricción. 
• Vector: Vector de expresión pET22b(+) (Novagen). 
• Célula receptora: Transformación (procariota)- células de E. coli BL21 (DE3) 

• Mecanismo de transferencia o inserción del gen:  Conjugación por electroporador MicroPulse 
• Método de identificación de clones: electroforesis preparativa en gel de agarosa, Electroforesis del PCR de colonia de E. coli BL21, espectrofotometría, PCR, secuenciación, cultivo, Mapa del vector de expresión pET-22b(+) (2).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Microbiología médica.9aed. España: Elsevier;2017. 137-141p. 
2. Bulbarela JG. Clonación y expresión de la conotoxina recombinante cal26a de Conus californicus en Escherichia coli [Internet]. [Ensenada, Baja California, México]: intro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada; 2017 [citado el 23 de enero de 2023]. Disponible en: https://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1007/657/1/242751.pdf

Evaluación de la técnica Western blot para la detección de antígenos de Hymenolepis nana

En el artículo se verifica la efectividad del método de Inmunoelectrotransferencia o Western Blot en la detección de antígenos específicos de secreción/excreción de la Hymenolepis nana o también llamada “tenia enana” utilizando sueros de pacientes con himenolepiosis y con otras helmintiosis confirmadas. Para el procedimiento, los antígenos de H. nana obtenidos fueron contrastados con 12 sueros individuales de pacientes con himenolepiosis presente, resultando que cada suero reconoció diferentes bandas antigénicas, sin embargo, la de 50,1 kDa,  es la que fue reconocida por todos ellos.

Figura 1. Bandas de los antígenos de excreción /secreción de Hymenolepis nana detectados por la técnica de “Western blot” utilizando sueros individuales de paciente con himenolepiosis confirmada. (A) sueros de pacientes con himenolepiosis con- firmada. (B) Sueros controles. Recuperado de: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=195018549016

Referencias bibliográficas:

1. Chávez-Salas F, Vásquez O, , Escalante H.  Evaluación de la técnica Western blot para la detección de antígenos de Hymenolepis nana. Revista Peruana de Biología [Internet]. 2007;14(2):283-286. Recuperado de: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=195018549016

Análisis de la técnica de PCR en el cáncer colorrectal

T-Tema: Caracterización molecular de pacientes con cáncer colorrectal 

O-Objetivo: Analizar cambios somáticos en los genes APC, KRAS, BRAF y TP53, y determinar la inestabilidad microsatelital y el patrón de metilación del gen MLH1 en 44 pacientes colombianos con cáncer colorrectal esporádico, así como correlacionar los datos clínico-patológicos con los hallazgos moleculares. 

M-Muestra: Muestras del tejido del tumor primario y del tejido normal adyacente (simultáneamente) del colon y recto, mediante resección quirúrgica. AN-Tipo de ácido nucleico: ADN genómico 

G-Genes a analizar: Genes APC, KRAS, TP53 y BRAF, en los genes APC (exón 15; región MCR), KRAS (exones 2 y 3), y TP53 (exones 5-8); a todos los tumores con inestabilidad microsatelital positiva se les hizo el análisis de la mutación V600E en el exón 15 del gen BRAF. 

PCR-Tipo de PCR: MS-PCR (Methylation-Specific PCR) 

V-Visualización: Electroforesis capilar

Referencias bibliográficas:

1.	Afanador CH, Palacio KA, Isaza LF, Ahumada E, Ocampo CM, Muñetón CM. Molecular characterization of colorectal cancer patients. Biomedica. 2022 May 1;42(Sp. 1):154-171. English, Spanish. doi: 10.7705/biomedica.5957. PMID: 35866738; PMCID: PMC9414253. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9414253/